肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Esche⁃richia coli，EHEC)O157∶H7可引起人出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)、溶血性尿毒综合征(hemo⁃lytic uremic syndrome，HUS)及血栓形成性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等。在O157∶H7 中，z1445 是功能未被注释的基因。我们欲研究z1445 基因的功能，首先通过Red重组系统敲除z1445 基因。Red系统是在大肠杆菌λ噬菌体中存在的一种区别于宿主的重组系统，该系统由exo、bet、gam 等3个基因组成。exo 基因编码外切核酸酶，能降解双链DNA的5'端链，产生突出的3'端;bet 基因编码的β蛋白能结合单链DNA，防止DNA被核酸酶降解，并启动互补链的退火和交换反应;gam 基因的编码产物能与宿主的RecBCD蛋白结合，抑制RecBCD 蛋白降解线性双链DNA 分子。该系统通过促进外源DNA与染色体DNA重组，将目的基因替换，从而达到敲除目的基因的目的。我们借助于Red系统将O157∶H7中的z1445 基因置换为卡那霉素抗性基因(kan)，并进一步依靠FRT位点将kan 基因去除，从而获得z1445 基因被精确敲除且不带kan 基因的O157∶H7突变株。

　　1 材料及方法

　　1.1 材料

　　EHEC O157∶H7 菌株EDL933，质粒pKD46、pCP20由本室保存;插入kan 基因的质粒pUC19-kan由本室构建;大肠杆菌DH5α感受态细胞、BL21(DE3)表达感受态细胞，pEASY-T1 simple载体，高保真TransStart Taq DNA聚合酶，DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司;基因组提取试剂盒购自Promega公司;限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB 公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒，质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;2 mm电击杯购自Bio-Rad公司;氨苄西林、卡那霉素、L-阿拉伯糖购自Sigma公司;PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

　　1.2 pUC19-z1445Up-kan-z1445Down质粒的构建

　　取5 mL过夜培养的O157∶H7 EDL933，用基因组提取试剂盒提取其基因组;查找GenBank公布的z1445 基因序列，根据其上、下游各500 bp的序列，用Primer 5.0软件设计PCR引物。以获得的基因组为模板，用引物Up F、Up R扩增z1445 基因上游的同源臂序列500 bp，用引物Down F、Down R扩增z1445 基因下游的同源臂序列500 bp。反应体系：双蒸水37.5 μL、缓冲液5 μL、dNTP 4 μL、F及R引物各1 μL、基因组模板1 μL、Easy Taq DNA聚合酶0.5 μL。反应条件：95℃预变性10 min;94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 个循环;72℃终延伸10 min;4℃冷却。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，用Easypure PCR产物纯化试剂盒回收纯化，送苏州金唯智生物科技有限公司测序。回收产物与克隆载体pEASY-T1 simple连接，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，提取质粒和pUC19-kan 载体同时进行双酶切(上游为HindⅢ、SalⅠ，下游为BamHⅠ、EcoRⅠ)，上、下游同源臂分别连接于pUC19-kan 载体的两侧，构建打靶片段pUC19-z1445Up-kan-z1445Down(以下简称pUC19-UKD);提取重组质粒，以重组质粒为模板，用引物Up F、Down R 扩增UKD 打靶片段，鉴定正确的UKD打靶片段经DpnⅠ内切酶处理，用于切除来自细菌的模板质粒，最后纯化回收线性打靶片段备用。

　　1.3 电转感受态细胞的制备与同源片段的重组

　　于5 mL LB培养基中按1∶100的比例接入大肠杆菌BL21(DE3)，37℃、200 r/min振荡培养过夜，次日按1∶100的比例转接到10 mL LB培养基中继续培养，待菌液D600nm达0.3时，添加L-阿拉伯糖至终浓度为20 mmol/L，振荡培养75 min，至D600nm 约为0.7时取出，冰上放置10 min，4℃、5000 r/m离心2 min收集菌体，用冰冷的ddH2O 洗菌体3 次，用冰冷的10%甘油洗菌体3次，最后用100 μL 10%甘油混匀菌体，4℃放置15 min，加入100 ng 纯化的线性片段，轻轻混匀后冰上放置15 min，转移混合物于预冷的电击杯中，继续放置10 min，擦干杯身，进行电击转化(电压2.5 kV，电阻200 Ω，频率25 μF)，电击完毕加入800 μL新鲜的LB，37℃、200 r/min培养1.5 h，取100 μL菌液涂布于含50 μL/mL卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，次日挑取单克隆，用Up F、Down R引物鉴定。

　　1.4 卡那霉素抗性基因的敲除

　　将已重组的阳性克隆传代培养稳定后，待菌液D600nm达0.6时，按前述方法制备感受态细胞，加入5μL pCP20质粒，冰上放置15 min，进行电转化，30℃倒置培养40 h，挑取单克隆，用Up F、Down R引物鉴定，将卡那霉素抗性基因丢失的单克隆转接后于42℃继续培养过夜，次日检测菌株抗性，并进行基因组定位测序，其中不具有卡那霉素和氨苄西林抗性的即为z1445 基因缺失突变株。

　　1.5 野生株及缺失株生长曲线的测定

　　将已活化的EHEC O157∶H7与z1445 基因缺失突变株按1∶100 的比例转接于100 mL 培养瓶中，37℃、200 r/min 培养，分别于前12 h 的每隔1 h 及24 h取样，测定菌液的D600nm值，制作生长曲线，比较菌株生长差异。

　　2 结果

　　2.1 z1445 基因上、下游同源臂打靶片段的构建及获取

　　用高保真Taq 酶扩增z1445 基因上、下游同源片段(500 bp，)，分别酶切连接于pUC19-kan 上，构建pUC19-UKD(2500 bp，kan 片段为1500 bp)，测序正确后，用引物Up F、Down R扩增UKD片段，纯化PCR产物，DpnⅠ酶切后用于电转化。

　　2.2 重组克隆的筛选与鉴定

　　挑选氨苄西林LB 平板上的单克隆，以引物UpF、Down R 鉴定重组菌，正确大小为2500 bp，命名为Δ1445∶∶kan。

　　2.3 卡那霉素基因的敲除及鉴定

　　利用pCP20质粒表达的FLP重组酶识别卡那霉素基因两端的FRT位点，敲除卡那霉素基因，以引物Up F、Down R 鉴定，缺失株扩增片段大小为1400bp，而野生株为2500 bp，。

　　2.4 野生株及z1445 缺失突变株生长曲线比较测定每小时菌液的D600nm值，监测10 h，绘制生长曲线如图5。结果显示，敲除z1445 基因后，细菌的生长并没有受到影响。

　　3 讨论

　　EHEC是对人类健康和食品安全造成重大威胁的病原菌，其通过注射器样Ⅲ型分泌系统将效应因子转移入宿主细胞内以促进细菌的感染。z1445是经生物信息学预测得到的一个EHEC效应因子，但其功能目前未知。

　　为研究z1445 的功能，我们欲获得敲除z1445 基因的缺失株EHEC。用Red重组系统进行基因敲除，可以直接利用线性打靶DNA，重组效率高，已被广泛应用于细菌的基因敲除中。研究发现，在Red系统的bet 基因作用下可以启动大肠杆菌染色体和短的单链寡核苷酸序列间发生重组，导致基因的敲除或置换。我们构建了长同源臂打靶片段，将z1445 基因上、下游各500 bp序列作为同源臂，采用基因工程方法，通过引入酶切位点，酶切、连接，使上、下游打靶片段与卡那霉素抗性基因整合在一起，成功地将大肠杆菌O157∶H7中的z1445 基因敲除。获得的z1445 缺失株与野生型EHEC相比，生长效率没有区别，更提示z1445 可能在细菌自身生长中并不发挥重要作用，而是作为效应因子在宿主细胞中发挥作用。z1445 缺失EHEC 株的构建，为后续研究z1445在EHEC致病中的功能奠定了基础。